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原标题:新城疫的流行趋势发生了变化,抗体可存在动物

浏览次数:198 时间:2019-09-05

(辽宁省铁岭市动物检疫站 铁岭 112000)

鸡新城疫是由鸡新城疫病毒引起的一种急性、热性、败血性、烈性传染病,我国采取以疫苗免疫为主的综合防控措施,有效控制了该病在国内的大规模流行,但新城疫疫苗免疫失败现象仍时有发生。雏鸡体内母源抗体水平是不同的,统一接种新城疫免疫疫苗后,对接种疫苗可产生不同程度的干扰因素.尤其雏鸡母源抗体水平偏高时,将严重干扰免疫接种的抗体效力,使其发挥不出应有的免疫作用,导致整个鸡免疫水平参差不齐。青海省湟源县鸡新城疫免疫抗体监测结果与分析,一起来了解一下!

新城疫是由新城疫病毒引起的和火鸡的一种急性、高度接触性和毁灭性的传染病。新城疫流行于世界各国,在150多个国家和地区都有此病发生。随着高度集约化养鸡业的发展,新城疫的防治也备受关注。近年来,新城疫的流行趋势发生了变化,以发病率低、临床症状不明显、病理变化不典型、死亡率低、蛋鸡产蛋量下降为特征的非典型新城疫,使得新城疫的防治变得更加复杂和棘手。新城疫目前仍然是严重危害我国养禽业的主要疾病之一,造成的经济损失十分巨大。除了大量死亡的直接损失外,还因幸存者生长发育受阻、饲料转化率低、产蛋量下降、受精率和孵化率降低以及封锁隔离等措施花费的大量人力和财力所造成的间接经济损失。

新城疫病是危害养鸡的一种严重传染病,对新城疫的防治要按免疫程序进行免疫。但首免日龄的确定、免疫后机体反应的效果如何,及其间隔多长时间进行第二次免疫,都取决于机体内的抗体水平。抗体可存在动物的血清中,可以通过免疫监测的方法检测出来。但是在免疫监测的实际操作中,监测结果受到诸多因素的影响。就在检测鸡ND抗体效价时应该注意如下问题,综述如下:

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由于机体免疫机能状况等很多因素的综合影响,使新城疫疫苗接种效果不佳,甚至免疫失败,新城疫的发病次数仍然很高。再者,由于近十多年来养鸡业的蓬勃发展,使鸡场的数量巨增,星罗棋布,使疫病种类更加复杂化、病情程度更加严重。为了更加有效地防治鸡新城疫,疫苗免疫后鸡新城疫抗体效价监测,常作为免疫效果评价的重要依据。检测家禽血清中鸡新城疫抗体的方法有很多种,包括单向辐射免疫扩散试验、单向辐射溶血试验、琼脂扩散试验、鸡胚中和试验及蚀斑中和试验、酶联免疫吸附试验以及血凝抑制试验与血凝抑制试验来定量测定鸡新城疫抗体。ELISA可以半自动化操作,其技术已经普及,并且ELISA与HI有很好的相关性。迄今为止,鸡红细胞血凝抑制试验仍不失为一种快速准确的试验手段。

1 抗原方面

1、材料与方法

本次监测采用HI方法,对市某户新城疫疫苗已免疫鸡群的1000只100日龄育成鸡进行检验,并结合农户的叙述及实地考察,做出该鸡群新城疫疫苗免疫效果评价,以便有的放矢地预防和控制该养鸡场的新城疫。

免疫监测实质上是一个抗原抗体反应的过程。在此,抗原的效价一定得标定正确,每次监测之前一定先准确测定抗原的效价,应该是同时测2~3遍取其平均值,然后根据其准确效价配制所需病毒液。

1.1 血清样品来源

抽检鸡 涿州市某蛋鸡场,从100日龄新城疫疫苗免疫育成鸡1000只中分别在100日龄和150日龄时随机抽取32只采血并分离血清。

2 抗体方面

于2014-2016年期间共采集湟源县鸡新城疫疫苗免疫后的血清样品3242份。

试剂和药品 鸡新城疫HA抗原、新城疫阳性和阴性血清,由中监所生产;氯化钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、柠檬酸三钠、葡萄糖、柠檬酸。

检测抗体水平,需取血清为检测样本。要采样的过程中及盛放样本的试管不能污染,不能含有杂质,不能含有与抗体无关的蛋白质。也不能加有抗凝剂,不能有溶血物,否则血清就不易分离或影响其抗体的效价。分离好的血清应该是淡黄色透明液体。

1.2 试剂和仪器

仪器微量震荡器 微量加样器、离心机、天平、手提式压力蒸汽消毒器、90oV型96孔血凝板、电冰箱。

3 红细胞方面

鸡新城疫血凝抑制抗原、阳性血清、阴性血清购自青岛易邦生物工程有限公司;114小型台式离心机为SIGMA公司产品;量程为5-50μL可调八道移液器为Thermo公司产品;ZW-A型微量振荡器为常州华冠仪器有限公司产品;一次性96孔“V型”微量反应板为南通市卫宁实验器材有限公司产品。

磷酸二氢钾13.6克

红细胞的制备非常重要。红细胞应采自没有免疫过的成公鸡,未成熟的公鸡红细胞较脆弱,易溶血,不能用。红细胞经过反复离心洗涤后配成0.75%为最好,实践证明,0.5%和1%的红细胞都不如0.75%的好,这是由于现在普遍使用的微量法测定,在96孔反应板上进行,红细胞量的多少也会影响结果,过多过少时都会影响结果的准确性。

1.3 血清样品的制备

高压灭菌,4℃保存,使用时作20倍稀释

4 操作过程

利用一次性1.omL注射器从免疫鸡的翅静脉处采集血液0. 5-0.8mL,将其全部打入1.5mL离心管中,将离心管依次置于37℃温箱th,2-8℃冰箱2h后,3000r/min离心10min,小心吸取上清液存入另一个1.5mL离心管中,即得血清样品, 20℃保存备用。

加蒸馏水至1000ml,加热溶解后调pH值至6.1,69kPa15min高压灭菌,4℃保存备用。

免疫监测是一种血清学试验,应以科学的角度来对待,应该注意好如下几点:

1.4血凝抑制试验操作方法与判定标准

鸡新城疫红细胞凝集试验参照文献,以微量法测试新城疫抗原HA价。

4.1 加样时,各种成分一定要掌握准确的剂量。移液器是定量的,但受操作者手用力的影响,用力大小不匀时,吸取的量就不均匀,用力正好在标定的刻度上,能吸取均匀等量的样液,这是一个要求技术人员反复操作熟练的过程。注意在取样时每次取样吸头中不得含有气泡,如果有气泡存在会占有体积,取样量又会因此而不准确,而造成检测结果的误差。

  1. 4.1 1%鸡红细胞悬液的制备

1%鸡红细胞悬液的制备:采取3只成年无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血与等体积阿氏液混合,用1倍稀释液洗涤3次,每次均以1000r/分钟离心10分钟,洗涤后用1倍稀释液配成1%红细胞悬液。4℃保存备用。

4.2 在每一次做抗体监测时都应该做回归试验,并且每个反应板都要做一个回归。还必须设有标准阳性对照和标准阴性对照,这样才能反映出每一个反应板中各个待测样品的真实情况。由于配备好的4单位病毒受外界因素影响,时常发生变化,可以根据回归试验的结果来判断样品检测结果的准确性。

在一次性5.0mL注射器中吸入2.o mL抗凝剂后,于健康公鸡翅静脉处采集血液2.O mL,分别采集3只公鸡,将3只鸡抗凝血液全部置于50 mL离心管中,加入10倍体积的o.Ol mol/L、pH 7.2的灭菌PBS,混合均匀,2000 r/min离心10min,小心吸取上清液舍弃,下层红细胞用40.o mL灭菌PBS重悬,2000 r/min离心10 min,上清液舍弃,利用灭菌PBS将下层红细胞配制成1%鸡红细胞悬液,4℃保存备用,于配置当天用完。

HA试验:自左向右于96孔V型血凝板的每1孔中加1倍稀释液25μL;吸取25μL的抗原滴加到第1孔,用微量加样器充分混匀后移取25μL,加于第2孔,依此法从左向右进行倍比稀释至第11孔,从第11孔吸取25μL弃取,第12孔不加抗原作阴性对照;每孔再加25μL稀释液;每孔均加1%红细胞悬液25μL,置微量震荡器震荡2分钟,室温下作用30分钟,将血凝板倾斜观察结果。

4.3 抗体免疫监测试验在室内温度下均可以进行,但是温度不同结果出现的时间是不同的,22~28℃条件下最适宜,有条件的可在恒温箱内进行反应。没有恒温箱的在自然条件下反应也可以,但是要掌握好观察结果的时间。

1.4.2 4个血凝单位抗原的制备

结果判定:以100%凝集的最大稀释孔为新城疫抗原价,即一个凝集单位,不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。第12孔为对照应不凝集。

4.3 操作时加入抗原和抗体后要在微量振荡器上进行一次振荡,让其作用后再加入红细胞,再进行第二次振荡,两次振荡的目的是使各样品充分混匀,达到充分作用的效果。然后放在22~28℃的温箱内或室温下作用,等候观察结果。

在96孔微量板的各孔加入25μL灭菌PBS,取25μL鸡新城疫血凝抑制抗原加入第1孔内,混匀后吸取25μL至第2孔,依次倍比稀释至第11孔,各孔分别加入25μL l%鸡红细胞悬液,微量振荡器上摇匀,室温静置30 min后观察结果,红细胞完全凝集的最高稀释度即为抗原的血凝效价。将抗原的血凝效价除以4即得4单位抗原的稀释倍数,利用灭菌PBS配置4单位抗原。

鸡新城疫红细胞凝集抑制试验参照文献,以微量法测试待检血清中的新城疫血凝抑制抗体效价。

5 观察和记录结果

1.4.3抗体效价的测定

4个血凝单位抗原的配置:根据以确定的新城疫抗原血凝价,计算4个单位抗原的稀释倍数,以一倍的稀释液配置出4单位抗原放入冷藏室待用。

反应分两个阶段,第一阶段是抗原抗体特异性结合阶段,发生得很快,但不是显肉眼可见现象;第二阶段是肉眼可见阶段,需要电解质参与,并受多种因素的影响。如果在25℃左右反应,15~18min可以观察结果;如果置于15~20℃下则需要18~22min观察结果;如果在15℃以下,则需要25min后观察结果等。观察结果时要边观察边记录,并在2~3min内再重复观察记录一次结果,核对一下第一次的结果。如果两次的结果相同,只是第二次更明显,可以说是检测成功。如果有可疑的样本应间隔2min再观察一次,仍不能准确判定结果的应重复操作一次。

在96孔微量板的各孔加入25μL灭菌PBS,取25μL血清样品加入第1孔内,混匀后吸取25μL至第2孔,依次倍比稀释至第10孔,1- 11各孔分别加入25 μL 4单位抗原,微量振荡器上摇匀,室温静置30 min。各孔分别加入25μL1%鸡红细胞悬液,微量振荡器上摇匀,室温静置30 min后观察结果,完全抑制4单位抗原凝集的血清最高稀释度即为检测样品的HI抗体效价,当血清样品HI抗体效价≥4 log2判为阳性,<4 log2判为阴性。

待检血清的制备:采取32只待检鸡血液各5毫升置入试管中,静置至血液凝集后以3000r/分钟离心2分钟,吸取血清待检。

6 监测结果的实际应用

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HI试验:于96孔V型血凝板上,自第1孔至第11孔各加稀释液25微升,11孔和12孔分别为抗原和红细胞对照;吸取25微升待检血清滴加到第1孔,用微量加样器充分混匀后移取25微升,加于第2孔,依此法从左向右进行倍比稀释至第10孔,吸取25微升弃去,12孔加稀释液50微升;除12孔外每孔中滴加25微升4单位抗原,室温下作用30分钟;每孔均加1%红细胞悬液25微升;振荡2分钟,室温下作用40分钟,待4单位抗原已凝集红细胞可观察结果。

一般鸡新城疫抗体免疫接种临界HI价为1:16~32或40,雏鸡免疫器官7日龄接近发育成熟,鸡体对新城疫疫苗的免疫应答是随龄期的增长而加强。科学推算首免日龄和加强免疫时间的公式是:雏鸡最适首免日龄=半衰期×(1日龄雏鸡HI抗体效价几何均数的以2为底的对数值-4) 5。

2、结果与分析

结果判定:以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度,即血凝抑制价。11孔的抗原对照应为100%凝集,12孔红细胞对照应为100%不凝集。

2..1 不同年份的检测结果

由试验结果可知该新城疫抗原的凝集价为1∶512,4个凝集单位抗原稀释倍数为1∶128。

美高梅电子游戏网址,如表1所示,共检出阳性样品2966份,平均免疫合格率为91. 49% (2966 j3242),其中2014年、2015年、2016年免疫合格率分别为88. 25% 、92. 07%( 940/1021)、94.17%(1050/1115),免疫合格率自2014 - 2016年呈现出逐步升高的趋势。

待检血清的新城疫抗体的血凝抑制价

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由凝集试验可知,抗原对照均为100%凝集,红细胞对照均为100%不凝集,各待检血清的新城疫抗体血凝抑制价;4份为log2,14份为3log2,12份为5log2,4份为6log2,4份为7log2,4份为8log2。

3、讨论

就以上结果进一步分析该鸡群新城疫疫苗免疫鸡,HI价≥6log2者占37.5%、≤5log2者占62.5%,其中≤临界值4log2者占25%,表明该鸡群免疫失败,应考虑重新进行免疫。该鸡群HI价均≤8log2,而且临床健康,HI价分布离散,可判定未发生新城疫病毒感染。该户根据我们的建议用新城疫油乳剂灭活苗对鸡群进行了新城疫重新免疫,免疫50天后重新进行抗体监测结果均≥5log2,且≤8log2表明该鸡群新城疫免疫抗体合格对新城疫病毒有一定的抵抗力。

疫苗免疫后抗体水平检测可有效判断疫苗的免疫效果,本次新城疫免疫效果监测覆盖了湟源县2 014 -2 016最近3年的时间跨度,并且分别从养殖场和散养户进行抽样检测,监测结果能够较好的反映出目前湟源县新城疫疫苗的免疫效果。本次调查平均免疫合格率为91. 49%,远远超过了农业部规定的免疫合格率在70%以上的标准。与国内其他地区相比,也远远高于甘肃宁县2015年平均为76. 31%免疫合格率[2],略高于福建浦城县2015年总体为91. 287%的免疫合格率[9]。表明湟源县已全面开展鸡新城疫的免疫工作,疫苗免疫程序比较合理,疫苗免疫效果较好。但本次调查中发现湟源县规模养殖场的平均免疫合格率较散养户高出8. 07个百分点,究其原因可能为:①在防控意识上,规模场的防控意识更强,投入了大量的人力财力,而散养户的防控意识较淡薄,少免、漏免等情况时有发生;②在技术水平上,养殖场有兽医专职人员负责防疫,技术水平较高,且经常进行抗体检测,能准确把握免疫时机,而散养户做不到抗体的实时监测,无法掌握免疫前的抗体水平,往往盲目免疫;③在养殖环境上,规模场的饲养管理与环境卫生均明显好于散养户,鸡群的免疫力和抗病力较好,可有效降低免疫失败。故对散养户定期组织培训,提高其防疫意识和技术水平,逐步引导其向规模场方向发展已十分棘手和必要。

本次监测新城疫疫苗免疫鸡群,

HI价低于5log2者占62.5%,其中处于或者小于3log2者占25%,该鸡群存在被新城疫病毒感染的威胁,大于或等于6log2者占37.5%,表明该鸡群免疫失败,应考虑重新进行免疫。该鸡群的HI价均小于或等于8log2,且HI价分布离散,可判定未发生新城疫病毒感染。该户根据建议对鸡群进行了重新免疫后,经监测新城疫抗体合格。

疫苗效价不高农户贪图便宜或方便就近从个体药店买些效价不高的疫苗用于鸡群免疫,致使免疫效果不佳。

免疫方法不当农户担心疫苗效力不够,选用3倍~4倍药量饮水,致使部分鸡能饮到超过正常剂量6倍~7倍的疫苗,这极易引起免疫麻痹或超过机体的免疫耐受力而使鸡发病;同时部分鸡只喝到很少一点疫苗,免疫力很差。

疫苗应用不合理养殖户认为灭活苗诱导产生的抗体水平较高,且维持时间长,因而首免就选用新城疫灭活苗进行肌肉注射,忽视了弱毒苗的免疫,造成免疫效果不佳。还有一些养殖户为了省事方便,该进行疫苗注射时不注射而采用饮水的方法进行免疫。前面我们进行监测的这1户就是在鸡群60日龄时没有用新城疫I系苗进行肌肉注射,而是用I系苗进行饮水免疫造成免疫不合格。

频繁免疫造成的免疫抑制近年来,农村养鸡户越来越认识到免疫的重要性,但有时在机体内抗体效价还很高且均匀度很好的情况下,盲目进行弱毒苗的免疫,容易造成抗体水平下降,鸡群容易在抗体下降时感染新城疫病毒。另一方面,由于抗原的频繁刺激,机体应答反应疲劳,形成免疫抑制。

免疫间隔时间长。由于雏鸡受母源抗体的影响和免疫器官发育不完善,首免后的抗体效价往往不高,下降较快,因此使用弱毒苗,在首免后3周之内应进行2免,时间间隔过长,容易造成免疫断当而染病。养鸡场因为鸡群状况不佳,总想把病治好了再去免疫接种,人为推迟免疫时间,结果因健康状况不佳,抵抗力下降。

鸡群免疫系统缺损影响鸡体的营养状况。农村养鸡的饲料多是自配料,随意性比较大,很容易造成某些营养物质,如某些必需氨基酸、维生素、微量元素的缺乏或不足,致使鸡体因营养不良而抑制免疫系统的功能。

各种应激因素的影响。如温度湿度的急剧变化、扩群、换料、饥渴等都能引起机体免疫系统功能的暂时性抑制,这时如果进行疫苗免疫接种很容易造成免疫失败。

免疫抑制性疾病的干扰。如传染性法氏囊病、传染性支气管病、马立克氏病等疾病都能降低免疫应答。

缺乏综合性防治措施。为降低养鸡成本,农村多采用大棚养殖,鸡舍简陋,保温、通风能力差,环境恶劣,致使鸡群抵抗力下降,一旦防疫和消毒措施不力,极易造成新城疫的发生和流行。尽管农户按照免疫程序及要求进行免疫,但忽视了对病鸡的隔离及消毒等防疫措施,病死鸡随便乱扔,甚至为了减少一点损失而将病鸡上市销售,造成疫病在更大范围内的传播流行。

防治措施隔离、消毒、严防病毒传入。紧急疫苗预防。用鸡新城疫多价油苗 IV系苗组,每只1毫升,进行紧急预防。

辅助预防。添加黄芪多糖和电解多维等提高鸡新城疫疫苗的免疫保护力。

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